摘要

凝膠滲透色譜（GPC）與多角度靜態(tài)光散射（SLS）相結(jié)合，是一種先進(jìn)且強(qiáng)大的用技術(shù)，能夠無(wú)需依賴傳統(tǒng)的柱校準(zhǔn)即可得到絕對(duì)分子量值。GPC-SLS 技術(shù)通過(guò)定量評(píng)估信號(hào)強(qiáng)度而不是通過(guò)洗脫時(shí)間來(lái)得到分子量。此外，與聚合物標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)不同，要準(zhǔn)確解讀光散射信號(hào)，需要知道樣品的準(zhǔn)確濃度、進(jìn)樣體積及相應(yīng)質(zhì)量等信息。

引言

凝膠滲透色譜（GPC）是一種用于測(cè)定蛋白質(zhì)、聚合物和許多其他納米材料分子量的有用技術(shù)。然而，其應(yīng)用受到必須使用已知分子量（M_w）標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì) GPC 柱進(jìn)行校準(zhǔn)的限制，這些標(biāo)準(zhǔn)樣品的化學(xué)性質(zhì)可能與未知樣品不同。色譜柱的分離機(jī)制基于流體動(dòng)力學(xué)和尺寸排阻。在使用不同的洗脫液時(shí)，某些樣品在洗脫過(guò)程中可能會(huì)粘附在固定相上，從而導(dǎo)致分子量測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。更好的方法是給 GPC 系統(tǒng)配備多角度光散射（MALS）檢測(cè)器，從而無(wú)需柱校準(zhǔn)即可準(zhǔn)確測(cè)量分子量。先通過(guò) GPC 對(duì)樣品進(jìn)行分離，然后由而 MALS 檢測(cè)器測(cè)量絕對(duì)分子量M_w。

布魯克海文儀器公司的分子量分析儀（BI-MwA）是一種多角度靜態(tài)光散射（MALS）檢測(cè)器，通常與BI-DNDC（示差檢測(cè)器）一起與 GPC 系統(tǒng)配套使用。通過(guò)光纖與內(nèi)部流動(dòng)池耦合，可在 7 個(gè)固定角度下采集信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)散射光的角度依賴性測(cè)量。使用這種檢測(cè)器配置進(jìn)行的典型 GPC 實(shí)驗(yàn)會(huì)生成包含多達(dá)三條曲線的色譜圖：紫外（UV）、示差（RI）和光散射（LS）。紫外檢測(cè)器通常不適合用于檢測(cè)合成聚合物，因?yàn)榕c蛋白質(zhì)樣品不同，合成聚合物往往只有極小的紫外吸收或無(wú)紫外吸收。光散射曲線可以展開，分別顯示每個(gè)角度的散射光強(qiáng)度。

基礎(chǔ)的 GPC 系統(tǒng)由單根色譜柱、進(jìn)樣器、泵和檢測(cè)器組成，高端 HPLC 系統(tǒng)則可能配備多個(gè)檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜柱恒溫箱等更多組件。無(wú)論那種情況，GPC 色譜柱本身和檢測(cè)器都是最重要的組件。布魯克海文公司的 MwA 能夠獲取現(xiàn)有 GPC 系統(tǒng)中各類檢測(cè)器的模擬輸出，從而提供額外的檢測(cè)功能，如粘度、紫外和示差。這些數(shù)據(jù)可以讀入布魯克海文儀器公司的尺寸排阻色譜采集軟件 ParSEC 中，以生成統(tǒng)一的色譜圖。通過(guò)整合這些數(shù)據(jù)，既能計(jì)算出色譜圖中任意一點(diǎn)的瞬時(shí)分子量，也能算出預(yù)選范圍內(nèi)的平均分子量。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置

分析

對(duì)所得數(shù)據(jù)有三種分析方式，可根據(jù)樣品的已知信息進(jìn)行選擇。對(duì)于未知樣品，可能有兩個(gè)已知參數(shù)：進(jìn)樣量和樣品的 dn/dc 值。

以下列出三種可能的情況：

結(jié)果

我們已經(jīng)證明了準(zhǔn)確測(cè)定色譜柱中注入樣品濃度的重要性。如下表所示，即使進(jìn)樣體積存在微小差異，表觀分子量（M_w）也會(huì)發(fā)生顯著變化。

使用正確進(jìn)樣體積與使用錯(cuò)誤設(shè)置體積計(jì)算的對(duì)比

上表示例展示了進(jìn)樣體積變化的影響。數(shù)據(jù)由布魯克海文儀器公司的 ParSEC 軟件采集，并以三種方式進(jìn)行分析。分析在已知濃度但未知 dn/dc 值的情況下進(jìn)行。從分析結(jié)果來(lái)看，得到的分子量也變化了約 1%，這說(shuō)明了進(jìn)樣體積變化的影響。

在典型操作中，ParSEC 軟件根據(jù) Zimm 方程生成 Zimm 圖，并將光散射數(shù)據(jù)外推至零角度，進(jìn)而計(jì)算出絕對(duì)濃度和分子量。由于只有單個(gè)濃度的數(shù)據(jù)，因此無(wú)法外推至零濃度。但是，與所有 GPC/SEC 軟件一樣，ParSEC 軟件允許對(duì)第二維里系數(shù)進(jìn)行校正。

結(jié)論

布魯克海文公司的 MwA 是一款功能強(qiáng)大的儀器，可以顯著提升現(xiàn)有 GPC 系統(tǒng)的性能。可重復(fù)的進(jìn)樣量對(duì)多角度靜態(tài)光散射（MALS）與 GPC、SEC 或其他色譜聯(lián)用技術(shù)至關(guān)重要。由于濃度是 Zimm 方程（見附錄）中的一個(gè)關(guān)鍵變量，而 Zimm 方程又是計(jì)算分子量的基礎(chǔ)，因此這一點(diǎn)十分必要。

• 分析方法的選擇。如果進(jìn)樣器的重復(fù)性不優(yōu)于 2%，最好選擇已知 dn/dc 值但未知進(jìn)樣量（濃度和進(jìn)樣體積）的分析方法。
• 進(jìn)樣器性能指標(biāo)。在分析 dn/dc 值未知的樣品時(shí)（這是最常見的情況），進(jìn)樣器的重復(fù)性應(yīng)優(yōu)于 1%。這一指標(biāo)很容易達(dá)到。
• 樣品濃度性能指標(biāo)。在分析 dn/dc 值未知的樣品時(shí)（這是最常見的情況），樣品濃度的準(zhǔn)確度應(yīng)優(yōu)于 1%。這一指標(biāo)也很容易達(dá)到。

附錄

光散射計(jì)算

在計(jì)算分子量時(shí)，通常使用 Zimm 方程來(lái)分析光散射數(shù)據(jù)：

Kc/ΔR = 1/M_w (1 + (q² R_g² )/3) + 2 A₂ c

其中，K為德拜常數(shù)，是聚合物-溶劑或蛋白質(zhì)-溶劑體系的一個(gè)常數(shù)。對(duì)于垂直偏振的光，

K = 4 π²n²(dn/dc)²/(N_aλ⁴)

其中n為溶劑折光率，N_a為阿伏伽德羅常數(shù)，λ為激光波長(zhǎng)。c 為聚合物濃度，在制備樣品溶液時(shí)精確確定，ΔR 表示溶液的散射光強(qiáng)與純?nèi)軇┥⑸涔鈴?qiáng)的差值，可通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)量。